构建方法

目前，中药指纹图谱技术已涉及众多方法，包括薄层扫描（TLCS）、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）和高效毛细管电泳法（HPCE）等色谱法以及紫外光谱法（UV）、红外光谱法（IR）、质谱法（MS）、核磁共振法（NMR）和X—射线衍射法等光谱法。其中色谱方法为主流方法，尤其是HPLC、TLCS和GC已成为公认的三种常规分析手段。由于HPLC具有分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快、应用范围广等特点；中药成分绝大多数可在高效液相色谱仪上进行分析检测，且积累较丰富的应用经验。

1、薄层色谱法（TLC）薄层色谱具有选用范围广,重现性好等优点，常用于中药各种成分的鉴别。用固定波长对薄层展开的各斑点作薄层扫描图谱比目测的层析图谱更为客观准确，因而具有更好的指纹鉴别意义。但由于受薄层板的质量和开放式层析系统等外界因素的影响，易引起一定的实验误差。

2、气相色谱法 (GC) 气相色谱是封闭性色谱，受外界影响较少，具有高性能、高选择性、高灵敏度等优点，适合于药材及制剂中挥发性成分指纹图谱的研究。一般使用质量型检测器-氢火焰离子化检测器（FID）。钱浩泉等用气相色谱法建立了高良姜及其边缘植物挥发油成分的指纹图谱。具体应用中多与质谱联用，不仅具有 GC 的高分离效能，而且兼备了质谱鉴定的高灵敏度和准确性。

3、高效液相色谱法 (HPLC) 高效液相色谱具有分离效率高，分析速度快，定量精密度高，检测器种类多，稳定性好等特点。不受样品挥发度和热稳定性的限制，比气相色谱法应用范围更广，样品中大多数成分均可在高效液相色谱仪上进行分析检测，是构建指纹图谱的主要方法之一。由于中药成分的复杂性，构建指纹图谱一般采用梯度洗脱，因为逐步提高流动相洗脱能力可获得较多色谱峰，提供更多指纹信息。在考察条件时，要对指标成分和非指标成分都予以考虑，由于药材中各种成分的吸收波长及对不同检测器的响应不同，在构建指纹图谱时也需要加以考虑。实际应用中多使用多种联用技术，

充分利用各检测器的互补性，从不同角度反映药材及制剂的全貌，从各种图谱中得到结构信息。

4、高速逆流色谱法 (HSCCC) 它是目前国际上较新型的液－液分配色谱技术，利用相对移动的两种互不相溶溶剂，在处于动态平衡的两相中将具有不同分配比的组分分离。已有报道将 HSCCC应用于生物碱、黄酮、木脂素、蒽醌等天然产物的分离分析。具有分离效率高，溶剂用量少，无吸附，样品回收率高,重现性好和适用范围广等优点。

5、高效毛细管电泳法 (HPCE) 高效毛细管电泳技术是以高压电场为驱动，毛细管为分离通道，依据样品中各组分淌度和分配行为上的差异而实现高效快速分离的新型电泳技术。毛细管电泳的广泛应用取决于其多变的分离模式，几乎涉及分析化学中所有的分离对象，小到无机离子，大到蛋白质和高分子聚合物，也能够分析不带电荷的中性物质。具有所需样品少、溶剂消耗少、抗污染能力强、可直接分析水溶液等优点。其中毛细管区带电泳 (CZE) 和胶束电动毛细管电泳色谱 (MECC) 是中草药分析中最常见的两种模式。但该方法的重现性有待提高。

6、紫外可见光谱 (UV) 紫外可见光谱反映不同化学物质的电子共扼体系特征，具有加和性，对于混合物的鉴别专属性差，分辨率低，故紫外光谱很少用于指纹图谱的构建。

7、红外光谱和近红外光谱 (IR) 红外光谱是由分子的振动－转动能级跃迁产生的光谱，红外光谱具有高度的特征性。近红外光谱法在中药质量控制方面有较好的应用前景。

8、核磁共振法 (NMR) 从纯有机化合物的核磁共振氢谱上可获得结构信息，包括各类质子的化学位移、数量核偶合关系。核磁共振谱具有高度的重现性和特征性，易于解析和进一步研究，可评价药材和中成药质量的均一性和稳定性。

9、质谱法 (MS) 将中药提取液置质谱仪中进行电子轰击电离，可获得提取液中化学成分的质谱指纹谱，不同中药提取液所含成分不同，所得质谱图显示的分子离子峰及进一步，裂解碎片峰不一致，可供鉴别。

10、X射线衍射法：物质被X射线照射可产生不同程度的衍射现象，只要某一混合物的组成是恒定的，其衍射图谱可以作为该混合物的特征图谱。该法具有图谱指纹专属性强，信息量大,所需样品量小等诸多优点，X射线衍射法在动物类药材鉴定与辨别中有独特的优势。

11、分子生物学法 (DNA) 利用聚合酶链反应从不同生物样品中人工合成 DNA片断，而这种 DNA片断的大小、数目可因不同的生物而异，故称之为 DNA指纹图谱。该技术具有重复性好、灵敏度高的优点。限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）是最常用的构建 DNA指纹图谱的方法，但该法费时费力，应用受到限制。随机扩增多态 DNA（RAPD）标记，可以在特异 DNA序列尚不清楚的情况下，检测DNA的多态性，这是构建中药指纹图谱的新方法，具有极好的应用前景。罗志勇等采用 RFLP技术,分析了人参、西洋参基因 DNA指纹图谱。

分析、技术

随着分离分析技术的发展，中药质量研究也由过去“四大鉴别”(基元鉴别、性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别)发展到反映中药材全貌的指纹体系，即反映中药材的多元化学组成特性的化学指纹图谱和反映生物体 (除矿物、树脂类外) 特性的基因指纹图谱，从有效成分和遗传物质两方面实现对中药材的质量控制，为中药材以及中成药提供综合的和可量化的质量评价方法。

1、化学指纹图谱

中国中药指纹图谱的研究已有相当的基础，最早可以追溯到20世纪60年代，如采用薄层色谱、紫外光谱、红外光谱法来描述中药材主要成分的特征，这是早期的原始的指纹图谱，具有直观、在简单情况下容易比较差异的优点。随着分析技术的飞速发展和微电脑的广泛应用，基于化学计量法的中药指纹图谱的研究方法向高效、灵敏、专属、智能化、联用型的方向发展，高效液相、高效毛细管电泳、高速逆流色谱、核磁共振、近红外光谱等新兴分析技术的应用和各种数学分析方法的运用，为中药指纹图谱的研究与发展提供了广阔的前景。

2、紫外光谱指纹图谱

紫外光谱法是1995年以前指纹图谱常用的方法。由于不同中药所含的不饱和程度有差异，因而导致其紫外吸收曲线的形态、峰位、峰强度亦有差异，以此达到鉴别效果。常用导数光谱及结合各种数学分析法来消除样品中的一些无关吸收，排除原图谱中的某些干扰。

3、荧光光谱

中药注射剂常含荧光性物质，但因不同注射剂所含具体荧光性物质不同，同种注射剂又因厂家的具体配方的差异或制备工艺条件的波动，均会使其特征的荧光激发、发射光谱不同或其强度呈现差异；根据注射剂的荧光图谱的差异达到快速鉴别、认定和控制配方、工艺的目的。

荧光光谱不像红外光谱那样具有明显的指纹特征，但具有高灵敏度的显着优势，且差异更为一目了然，易于判断，因此，可以作为红外光谱指纹技术的一种补充，用于中药注射液的鉴别和认定，以及生产工艺的控制和成药热稳定性研究等。

4、色谱指纹图谱

色谱指纹图谱最实用、应用也是最广泛。中药色谱指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴别手段，是当前符合中药特色的评价中药真实性、稳定性和一致性的质量控制模式之一。色谱指纹图谱最大的优点是具有分离的功能。

TLC为传统的定性、半定量分析方法，在中国“七五”、"十一五”及“九五”公关课题中有大量采用薄层色谱法进行地道药材的定性鉴别。该法操作简单、分析速度快速、一次分析样品多，提供信息量大，用固定波长对薄层展开的各个斑点进行扫描，所得扫描图谱比目测的层析图谱更加客观准确，因此具有较好的指纹鉴别意义。其最大的缺点是重现性以及精密度差，所以在指纹图谱应用中受到限制，但可以作为中药指纹图谱研究的借鉴和补充。

5、气相色谱(GC)指纹图谱

GC最适合于各种主含易挥发性成分药材及其制剂的分析，尤其是毛细管气相色谱法，分辨率很高，往往一个色谱可以分出百个成分。该法灵敏度高、分离度好，分析速度快，但是分析范围只是局限于低沸点成分，是指纹图谱研究的主要方法之一。

HPLC适用于成分复杂而不易分离的分析对象，具有分离效能高，灵敏度高，分析速度快，不需要气化，检测手段多等优点，是目前指纹图谱技术中用途最广泛的一种方法。

HSCCC是当前国际流行的新型的液-液分配技术。应用动态液一液分配原理，利用相对移动互不混溶的两相溶剂，在处于动态平衡的两相中将具有不同分配比的样品组分离。其特点是不用固相载体作固定相，克服了样品吸附、损失、峰形拖尾问题。操作更为简便，容易掌握。对样品的预处理要求低，仅需一般粗提物即可。该技术的回收率高，能实现梯度操作，亦能重复进样，在中药质量分析控制研究中，尤其在指纹图谱研究中有较好的应用前景。

毛细管电泳(CE)又叫高效毛细管电泳(HPCE)，以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为的差异而实现分离的电泳分离分析方法，是近年发展起来的一种新的分离技术，是电泳技术和层析技术结合的产物，兼有高压电泳的高速高分辨率及HPLC的高效率等特点，其选择性与高效液相有很大的互补性。因此在指纹图谱研究方面的应用越来越广泛。

联用技术：由于中药复方制剂成分复杂，现行的各种单一测定方法给出信息少均无法建立较完善的指纹图谱，因而有人提出建立多维指纹谱尝试解决这一问题。所谓多维，即采用多种分析仪器联用的模式来测定指纹图谱，各谱图间相互补充信息，可对复杂供识品有更清晰完整的认识。目前最常用的是高效液相（或气相色谱）/二极管阵列检测器/质谱/质谱联用方式 (HPLC或GC/ DAD/ MS/ MS) 所得的多维指纹图谱。多维谱的建立既能较系统、较完整地解决中药复方制剂质量控制的难题，又为中药研究中缺乏标准品的难题提供了种新的解决途径。

6、X射线衍射法

当某一物质进行衍射分析时，该物质被X射线照射而产生不同程度的衍射现象。可分为单晶X衍射法与粉末X衍射法。物质组成、晶型、分子内成键方式、分子的构型等决定该物质产生特有的衍射图谱。如果该物质是一混合物，X-射线衍射图是各混合物各组分衍射效应的叠加。只要这一混合物的物质组成是恒定的，其衍射图谱可以作为该混合物的特征图谱。X -衍射指纹图谱具有指纹性强，图谱稳定可靠等特点。尤其是X衍射Fourier谱分析法可用于动物类药材的鉴定与伪品识别。

7、核磁共振(NMR)指纹图谱

核磁共振氢谱(1H-NMR)是鉴定有机化合物结构的重要的方法之一。它可以获得化合物的包括各类质子的化学位移、数量、偶合关系等多个结构信息。如可以用一定程序获取植物类中药的特征性化学成分(或化学成分组)的总提取物，同时这些特征的化学成分的含量是相对固定的，则在规范的提取分离条件下，植物类中药的1H-NMR图谱与植物品种存在着严格的对应关系，没有混淆的可能性。图谱中的信号强弱反映了混合物中各组分的相对含量。在对特征总提物进一步分离得到单体后，通过结构鉴定和NMR研究，可以对指纹图谱中的各特征谱线进行归属。

8、分子生物指纹图谱

随着分子生物学技术的迅速发展，DNA分子技术己越来越多的用于中药材品种鉴别的研究。分子生物指纹图谱是指采用分子标记技术得到的某一中药材品种的DNA指纹图谱。如对于人参、西洋参一类中药材的鉴别，用传统的方法(性状、显微、理化等鉴别方法)都显片面性，结果往往很模糊，因而其产地、生长年限、加工方式等因素与其性状和成分不呈很强的相关性，但应用分子生物学技术可以迎韧而解。